防己的提取工艺研究
确定防己的提取工艺为盐酸冷浸提取工艺，工艺参数为：提取溶剂1%盐酸溶液每次3倍量、室温冷浸2次、每次24 h、5%氢氧化钠调节PH值。本次防己提取工艺研究相对于乙醇回流法提取效果好，生产成本低廉，生产效率高，节省水、电等能源消耗。采用5%氢氧化钠调节pH值能解决使用氨水调节pH值刺激性问题。为防己提取生产工艺提供了参考依据。
本品为防己科植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根，主产于浙江、安徽、湖南、湖北、江西等地[1]。目前的研究显示防己含有的生物碱包括粉防己碱、防己诺林碱、轮环藤酚碱、氧化防己碱、N,N-二氯甲基粉防己碱、防己斯任碱以及小檗胺等，其中主要含有异喹啉类生物碱粉防己碱和防己诺林碱。李行诺等还从防己中分离得到N-氯甲基防己碱、粉防己碱-D-盐酸盐、荷苞牡丹碱、tazopsine等生物碱成分[2]。此外在其地上部分中还含有防己醌碱、紫堇醌碱、南天竹啡碱、氧化南天竹啡碱、无根藤米里丁、无根藤新碱等阿朴啡类生物碱[3]和防己双黄酮甲、乙等成分[4]。《中华人民共和国药典》2015年版一部中防己就是以粉防己碱和防己诺林碱作为其指标性成分进行定量[5]。
药材：防己购于亳州药材市场，经江西普正制药有限公司质量管理部检测为防己。
使用的仪器与试验材料包括：
•高效液相色谱仪：waters1525型高效液相色谱仪；
•色谱柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×250 mm）（美国WATERS公司）；
•JK-100型超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）；
•SHB-ⅢS型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；
•RE-5203A型旋转蒸发仪（上海振捷实验设备有限公司）；
•HHS-24型电热恒温水浴锅（上海东星建材实验设备有限公司）；
•SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海雅荣生化设备仪器有限公司）。
试剂：乙腈为色谱纯，水重蒸水，其余试剂为分析纯。
根据粉防己碱和防己诺林碱的理化性质，由于粉防己碱和防己诺林碱的水溶性较差。作者采用了醇提法和酸提法进行研究，并以水提法作为参照；选择醇提法、酸提法和水提法对粉防己药材进行提取，结合HPLC法测定粉防己碱和防己诺林碱含量，对提取工艺进行初步研究。
醇提法
称取防己药材200 g，用80%乙醇（V/V）回流提取两次，每次加入1200 ml的80%乙醇，每次2 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至1000 ml，再取1 ml用乙腈定容至25 ml，即得供试品溶液。
酸提法
称取防己药材200 g，用1%盐酸（V/V）冷浸2次，每次加入600 ml的1%盐酸，每次48 h；滤过，合并滤液，浓缩后加水定容至1000 ml，再取1 ml用乙腈定容至25 ml，即得供试品溶液。
水提法
称取防己药材200 g，用水煎煮2次，每次加入1200 ml水，每次2 h，滤过，合并滤液，浓缩后加水定容至1000 ml，再取1 ml用乙腈定容至25 ml，即得供试品溶液。
检测方法
含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-水-冰醋酸（40：30：30：1）（每100 ml含十二烷基磺酸钠0.41 g）为流动相；检测波长为280 nm。理论板数按粉防己碱峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 ml含粉防己碱0.1 mg、防己诺林碱0.05 mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，精密加入2%盐酸甲醇溶液25 ml，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用2%盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，置10 ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 µl，注入液相色谱仪，测定，即得。
合格标准
本品按干燥品计算，含粉防己碱（C38H42N2O6）和防己诺林碱（C37H40N2O6）的总量不得少于1.6%，即16 mg/g。
实验结果
所得提取液中粉防己碱和防己诺林碱总量的数据如表1所示。
①80%乙醇提取和1%盐酸冷浸所得的粉防己碱和防己诺林碱的总量相当，1%盐酸冷浸法稍高；
②水煎煮提取法所得的粉防己碱和防己诺林碱约为前两种方法的一半。这与粉防己碱和防己诺林碱不溶于水，溶于有机溶剂；成盐后溶于水的脂溶性生物碱的性质有关；
③从生物碱转移量方面考虑，采用乙醇提取和盐酸水冷浸都是合适的方法；
④1%盐酸冷浸提取方法的粉防己碱和防己诺林碱得率最高，成本较低，但提取时间较长；
⑤80%乙醇回流提取方法的粉防己碱和防己诺林碱得率略低，成本较高，但提取时间较短；
⑥水煎煮提取方法的粉防己碱和防己诺林碱得率最低，成本较1%盐酸冷浸方法也要高得多；
⑦从成本方面考虑，最适宜的提取方法应为盐酸冷浸提取法。
采用单因素法对盐酸冷浸法的工艺参数进行考察，考察项目为不同浓度盐酸的考察冷浸时间、冷浸盐酸浓度、不同冷浸时间和碱溶液不同pH值的考察。
合格标准
本品按干燥品计算，含粉防己碱（C38H42N2O6）和防己诺林碱（C37H40N2O6）的总量不得少于1.6%，即16 mg/g。
考察结果
不同浓度盐酸的考察结果：药材250 g，粉防己碱和防己诺林碱总重量4.75 g。分别选用1%，0.5%，0.25%的盐酸(V/V)冷浸；均冷浸2次，每次3倍量溶剂，每次24 h；结果见表2。
结论是，粉防己碱和防己诺林碱的总浸出量随盐酸浓度的增大而增大，由于1%盐酸冷浸的效果与80%乙醇回流的效果相当，同时考虑到盐酸浓度过高不利于实际生产，所以采用1%盐酸冷浸即可。
不同冷浸时间的考察结果：药材250 g，粉防己碱和防己诺林碱总重量4.75 g。选用1%盐酸3倍量冷浸一次，冷浸时间分别选择48 h和24 h，冷浸结果见表3。
结论是，冷浸48 h和冷浸24 h对粉防己碱和防己诺林碱转移率几乎没影响，冷浸24 h粉防己碱和防己诺林碱溶出即已达到平衡。采用冷浸时间为24 h即可。
碱溶液不同pH值的考察结果:药材250 g，粉防己碱和防己诺林碱总重量4.75 g。选用了氨水和5%氢氧化钠溶液调节冷浸液pH=9左右沉淀生物碱，结果见表4。
结论是，选用的碱不同，对获得的粉防己碱和防己诺林碱的总量会有一定的影响。5%氢氧化钠碱性比较强，可能会对得到的粉防己碱和防己诺林碱造成一定的损耗。同时与加入5%氢氧化钠的速度可能也有关系，加入过快可能会造成局部浓度过大，局部pH值过大。但考虑生产过程中使用氨水刺激性比较大，对工人的身体有一定程度的上伤害，故以5%氢氧化钠调节pH值为宜。
盐酸冷浸法考察结论：根据上述实验结果，我们确定盐酸冷浸法提取粉防己的工艺参数为：采用药材3倍量的1%盐酸溶液（V/V）冷浸2次，每次24 h，合并酸水液，加5%氢氧化钠调节pH=9左右，粉防己碱和防己诺林碱含量检测均符合质量标准要求，工艺重现性好。
实验过程发现，粉防己碱和防己诺林碱均为极性较小的脂溶性生物碱，其在水中的溶解度较小，即便是在煎煮条件下，溶出的效果也不会太好；同时由于防己含淀粉比较多，在水煎煮时淀粉容易煎出，也容易糊化，可能会对粉防己碱和防己诺林碱的煎出产生影响，导致粉防己碱和防己诺林碱的转移率较低。
本次防己提取工艺研究最佳工艺参数为：提取溶剂1%盐酸溶液每次3倍量、室温冷浸2次、每次24 h相对于乙醇回流法提取效果好，生产成本低廉、生产效率高节省水、电等能源消耗。采用5%氢氧化钠调节pH值能解决使用氨水调节pH值刺激性问题保护员工身体。为防己提取生产工艺提供了参考依据。
[参考文献]
［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：科学技术出版社，1999，8，385-389.
［2］ 李行诺，闫海霞，沙娜等. 粉防己生物碱化学成分的分离与鉴定[J]. 沈阳药科大学学报，2009，26（6）：430-433.
［3］ 司端运，赵守训. 粉防己地上部分的阿朴啡类生物碱成分[J]. 济宁医学院学报，1991， 14（2）：1-6.
［4］ 司端运，赵守训. 粉防己地上部分的非生物碱成分[J]. 济宁医学院学报，1993， 16（2）：1-5.
［5］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部(M).北京：中国医药科技出版社，2015：148-149.
