基因研究在风湿病学领域催生的革命

2017年06月25日 18:00 新浪医药

拂晓

新浪医药专栏作者，涓涓细流，汇聚沧海；星星之火，终至燎原。聆听医药行业的风吹草动，瞭望医药健康的百世航程。

◆ ◆ ◆

申请成为专栏作者，或原创投稿

请联系：editor@med.sina.com

　摘要　

易感性风湿性疾病，如骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎(AS)、系统性红斑狼疮(SLE)、幼年特发性关节炎( JIA)和银屑病性关节炎(PsA)，涉及到一个很大的遗传组分。了解个体的遗传背景如何影响疾病的发病和预后，可以使我们更好地了解疾病生物学，改进诊断和治疗，最终，达到疾病的预防或治愈的目标。在过去的数十年，对影响风湿性疾病风险的基因变异体的识别取得了巨大进展。阐明这些变异体的功能这一极具挑战性的工作在持续推进。本文试着梳理以下两个方面的内容：一、在风湿性疾病领域，因技术、生物信息学和研究设计等方面的进步获得的主要遗传学研究成果；二，风湿性疾病的关键基因研究，让我们对疾病重叠，病理通路和潜在的新型治疗靶点有了新的认识。

风湿性疾病基因研究历程

对于风湿性疾病，基因研究开始于1950s，随着技术的进步和经验的累积，基因研究在近70年来取得了很多里程碑式的成果，如图1所示。

图中的一些缩写：

AMD：age-related macular degeneration（老年性黄斑变性）；

CHi-C：capture Hi-C；

CRISPR：clustered regularly interspaced short palindromic repeats（成簇的、规律间隔的短回文重复序列）；

GWAS：genome wide association study（全基因组关联分析）；

RA：rheumatoid arthritis。

图1 风湿性疾病基因研究主要成果

技术上的突破

几十年来，生物领域前沿技术日新月异，这为基因研究奠定了坚实的基础。国际上纷纷建立了很多研究风湿性疾病的平台与联合项目，同时也推出了很多研究的新方法，如表1所示。

图中一些缩写：

eQTL：expression quantitative trait loci（表达数量性状位点）；

GWAS：genome-wide association study（全基因组关联分析）；

SNP：single-nucleotide polymorphism（单核苷酸多态性）。

表1 技术的进步与平台发展促使风湿性疾病领域的基因研究取得革命性突破

研究进展	描述	应用领域和贡献
	项目合作平台
1000 Genomes project	一个大型的测序项目，涉及26个种群的2504个基因组，旨在提供人类变异和基因型数据的最大公共目录。	该目录使研究人员能够推断出在人群中大量变异的基因型，而只有一小部分的SNPs是遗传性的，不需要重新测序。
Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE)	一个国际合作机构，目标是建立人类基因组中所有功能元素的综合目录。	鉴于大多数GWAS变体都映射到基因组的非编码调控区域，因此，破解这些调控因子的确切功能和机制对于阐明病理学至关重要。
Human Genome project (HGP)	一个旨在对整个人类基因组进行测序的项目	精确测定基因组中碱基对的序列，对任何基因研究的设计都至关重要。
The international HapMap project	通过对来自11个祖先群体的1,301名个体所发现的所有snp进行测定，该项目使高度相关的SNPs或单倍体类型得以识别。	HapMap帮助减少了检查整个基因组的snp数量，以便与特定的表现型相关联。这个数字从1000万个snp中减少到大约100万个“标记”SNPs。HapMap的最初努力已经得到了极大的扩展，无论是个体数量(数万人)还是人口数量，这足以为早期的GWAS研究提供信息。
Wellcome Trust Case Control Consortium (WTCCC)	英国50个研究小组开展的第一个主要的GWAS，其中包括7个常见疾病。	通过大样本的使用，广泛的合作使得检测出了能够使疾病风险降低的snp。
	研究方法
Cross-disease meta-analysis	将不同疾病的 GWAS 数据组合在一起。	这种方法增加了检测跨疾病的风险变异的统计能力。
GWAS	一种使用SNP基因分型阵列的方法来识别那些具有特定特征的人比没有特征的人更频繁地出现的变异。	了解疾病的遗传易感性可以对疾病相关的生物机制有更深入的了解，有利于更好的诊断和治疗疾病，最终预防或治愈疾病。
Meta-analysis	对多项研究结果综合分析研究。	这种综合分析提高了研究的能力，并增加了对结果价值的预估能力。
Multi-ethnic GWAS	多民族研究融合了多个种群的基因型数据;相比之下，大多数早期的GWASs关注的是欧洲血统的人口。	这种方法支持在独立种群中进行大规模复制，跨种群的元分析来增加权重，候选基因的优先次序和变异体功能的精细刻画。
Validation study	在一个与被绘制的原始样本分离的种群中进行，对已经通过了具有统计学意义的阈值的一组GWAS标记进行研究。	验证研究对于确认GWAS的结果和消除假阳性和过高估计的效果是至关重要的。
	新技术
Bayesian methods	贝叶斯方法则将概率解释为信念度（degree of belief）（不需要大量的实验）。当考虑的试验次数非常少的时候，贝叶斯方法的解释非常有用。此外，贝叶斯理论将我们对于随机过程的先验知识纳入考虑，当我们获得的数据越来越多的时候，这个先验的概率分布就会被更新到后验分布中。	贝叶斯方法的计算方法可以直接比较各个研究中的SNPs，促进元分析。还可以应用它们来定义可信的SNP集，从而提高定位的精细度。
CRISPR/Cas9	一种基因组编辑技术，可以在细胞和生物的基因组中进行位点特异性的修饰。	这项技术将是了解疾病相关等位基因影响疾病结果和/或进展的机制的关键。
eQTL analysis	eQTL是包含DNA序列变异的基因组的区域，它影响着一个或多个基因的表达水平。	这一分析将DNA序列变异与表型联系起来，并帮助识别出因果基因。
Fine-mapping	在大量病例和对照组中，解析一个相关的DNA区域内的所有已知变异的基因型。	能够在给定的地点识别变异，并提供最有效的因果联系的证据。
Hi-C	全面检测哺乳动物细胞核中染色质的相互作用的方法。这一技术已经证明了调节因子空间距离的重要性与它们调控的基因的重要性。	hi-c的研究有助于识别致病基因。他们已经证明，与SNP最接近的基因并不一定是因果基因;包含与疾病相关的变异的DNA区域之间的相互作用可以与远端因果基因相互作用。这一发现挑战了将GWAS变异基因标注为最近基因的传统。
Immunochip	为已被GWAS鉴定的186个自动免疫位点定制的SNP阵列。	Immunochip帮助发现了新的风险位点，改善了联系的峰值，并在位点上确定了二级独立影响。
Resequencing	对一个感兴趣的DNA区域进行重新测序。	在精细测序之前发现任何非在编目录的变体，确保选择的位置的完整覆盖。
SNP genotyping array120	一种DNA微阵列，用来检测基因组中成千上万的SNPs。	通过高通量、低成本的方式识别整个基因组中的疾病关联。

疾病交叉重叠

基因分析可以阐明各疾病间遗传相似性。比如通过组合数据分析多种血清反应阴性的疾病（seronegative diseases），一项研究就证实，克罗恩病（Crohn’s disease）和炎症性肠道疾病（IBD）与强直性脊柱炎（AS）有一些重叠的疾病关联位点。其他的基因研究表明，IL-17-IL-23信号通路是自身免疫性疾病病理机制重叠的枢纽所在，这个发现可以让那些针对此靶点的药物重新获得使用范围，比如ustekinumab（优特克单抗）。统计分析发现，虽然在疾病分类上幼年特发性关节炎（JIA）属于风湿性疾病，但与JIA更为相像的是I型糖尿病—另一种青少年时期发作的自身免疫性疾病。重叠基因涉及IL-2通路，包括IL2、IL2RA 和 IL2RB。与此类似，与银屑病性关节炎（PsA）相关的致病基因与类风湿性关节炎（RA）的致病基因几乎没有重合的部分，但PsA的致病基因与牛皮癣（psoriasis）的致病基因几乎完全重合，与IBD的致病基因也高度重合，一些治疗方法对这些关联基因重叠的疾病起到了很好的效果。

各疾病间基因重叠表明，致病机理和治疗方法依然会发生重叠。风湿性疾病的基因重叠位点如图2所示。RA关键致病基因包括PADL4，它与蛋白质的瓜氨酸化有关。两种治疗RA疗效显著的生物制品是阿巴西普（abatacept）和 tocilizumab（托珠单抗），它们分别作用于靶点CTLA4 和IL6R上。

图2 5种风湿性疾病基因位点重叠图示

病理机制的分析

通过将相关基因放置在预先标注的通路上，研究人员利用基因研究证明了一系列的免疫和非免疫通路，这些通路驱使风湿性疾病的发生。在这些通路中，辅助性T细胞分化通路似乎在RA、JIA、PsA、SLE 和AS的发展中扮演了重要的角色。如图3所示。

图3 辅助性T细胞分化通路与风湿性疾病的关联

图中可以看到，受到抗原刺激T_H0细胞分化T_H1、T_H2、T_H17、Treg和T_FH细胞。粉红色标注的就是基因与疾病关联的区域。实线箭头表示直接相互作用，虚线箭头表示间接相互作用。

根据GWAS研究，与系统性红斑狼疮相关的易感基因分布在三个通路上：淋巴细胞激活（lymphocyte activation），特别是淋巴B细胞的激活，包括BLK、PRDM1、STAT4 和BANK1基因；先天性免疫(innate immunity)，特别是NF-κB和I型干扰素的通路上，包括由IRF5、IRAK1、TLR7和TLR9驱动的NFKB1和 IFN1；细胞凋亡（apoptosis），包括ATG5 和ITGAM。

分层医学方法

对于风湿性疾病，RA是分层医学方法最理想的实践领域。目前已经有多种生物疗法针对不同的通路，这些通路涉及与RA相关的易感基因，目前每一种疗法的有效率大约是40%。比如，对于变异型TYK2基因，Janus激酶信号转导器和转录激活器（JAK-STAT）信号通路的重要组成部分，与RA密切相关，同时与JIA、PsA、SLE 和AS有关。Tocilizumab（托珠单抗），一种IL-6受体抑制剂，作用于JAK-STAT信号通路，在治疗RA中被证实具有很好的疗效。新的研究证实，基因研究不只可以帮助发现新的靶点，更能厘清药物作用的生理机制，以便发挥最佳药效。

结语

近几十年来，在风湿性疾病领域进行的基因研究取得了很多成果，这帮助人们更加深刻地认识基因与疾病的关系。当然，与研究得出的答案相比，更多的是新增的问题。比如，研究者还没法搞清相关变异型对邻近基因功能的影响。想要阐明与疾病相关的变异型的功能还需对基因表达的调控机制有更深的了解。过去两年来，基因工程的研究进展呈指数增长，尤其在CRISPR-Cas9基因编辑工具的帮助下，研究者可以直面更多细节性的问题。比如，在基因编辑工具的帮助下，基因调控、DNA变异型和整个生理通路都可以实现人为精准操控，以此观察扰动对信号通路下游带来的影响。通过这些精细化的研究，人们在逐渐揭开复杂疾病的神秘面纱。